서울대학교 생화학실험 - Protein Expression & Purification (실험2) 결과레포트

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오늘은 해피캠퍼스에서 발췌한 “서울대학교 생화학실험 - Protein Expression & Purification (실험2) 결과레포트” 내용을 정리하여 알려드립니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Methods and Materials
4. Results & Discussion
5. Reference

 

본문내용일부

1. Abstract
이번 실험에서 2주에 걸쳐 단백질의 발현, 정제 및 분리 방법을 학습했다. 5주차엔 Histag + eGFP protein을 E.Coli에서 발현한 후, 이를 Histag + Ni-NTA resin을 이용한 column chromatography로 정제하였다. 정제된 sample 중 elution에 해당하는 것에서만 eGFP의 fluorescence를 관찰할 수 있었다. 6주차엔 정제된 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분석하였다. Elution 샘플에서 특정한 protein band가 진하게 검출되어, 정제가 성공하였음을 확인할 수 있었다.

2. Introduction
단백질은 아미노산이 연결된 macromolecule으로, 생물의 모든 세포에서 자신의 기능을 수행하고 있다. 따라서 생화학을 연구함에 있어서 단백질에 대한 이해는 필수적이다. 생물의 특정 기능을 수행하는 단백질이 무엇인지, 혹은 특정 단백질이 수행하는 기능이 무엇인지를 연구하기 위해선 우선 그 단백질을 분리하여 얻을 필요가 있다. 순도가 높은 단백질 샘플을 얻은 다음에야 이를 이용해 실험을 진행할 수 있을 것이다. 따라서 이번 생화학실험에선 원하는 단백질을 발현 및 정제하고, 분석하는 방법에 대해 학습한다.
5주차 실험에선 원하는 단백질의 발현 및 정제 방법을 학습했다. 이번 실험에서 정제할 단백질은 polyHis + eGFP 단백질이다. polyHis는 Ni-NTA resin에 대한 affinity를 부여하기 위해 추가된 것이며, eGFP는 형광이 있어 정제의 편리성을 위해 도입된 것이다. 이 단백질을 coding하는 gene을 가진 plasmid로 transformation된 E.Coli를 이용한다. 정제하고자 하는 단백질은 E.Coli의 plasmid 속 lac operon의 structural gene 자리에 들어가 있다. Lac operon은 negative, inducible system으로, 평소엔 repressor가 작용하지만 allo-lactose가 effector로 작용해 repressor를 억제한다. Allo-lactose와 구조가 유사하면서, desensitization이 되지 않는 IPTG라는 물질을 처리하면, repressor가 항상 작동하지 않게 되면서, 원하는 단백질의 over-expression이 가능하다. 단백질을 Over-expression한 후, 이제 이를 정제해야 한다.

 

참고문헌

Jeffery J. Whyte et al. Gene Targeting With Zinc Finger Nucleases to Produce Cloned eGFP Knockout Pigs. Mol. Reprod. Dev. 78(1), 1-3 (2011).
Lubert Stryer, Biochemistry (9th Edition) W.H. Freeman: NY, 332-447 (2019).
Marion M. Bradford. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254 (1976).
Laura Koontz, Methods in Enzymology (Vol 541) Academic Press: 3-10 (2014).

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